Место качественной модификации метода ПЦР в первичной диагностике ИППП и контроле эффективности лечения

Ивашков Е.А.

В немалой степени успеху полимеразной цепной реакции (ПЦР) способствовало появление на медицинском рынке высокотехнологичных коммерческих тест-систем, значительно упростивших и ускоривших проведение реакции. В то же время применение нового метода поставило и ряд вопросов, один из которых - интерпретация результатов ПЦР.

Высокая чувствительность метода имеет и оборотную сторону - выявляемые десятки и сотни копий микроорганизмов в пробе не всегда достаточны для возникновения заболевания. Положительные результаты ПЦР в отсутствие клинических признаков заболевания (нередко сопровождаемые отрицательными результатами других лабораторных исследований) позволило предъявить обвинения этому методу в гипердиагностике. Открытым остаётся вопрос о трактовке результатов контрольных исследований методом ПЦР: качественный метод не позволяет достоверно оценить динамику популяции возбудителя под влиянием проводимого лечения.

Тест-системы, создаваемые для количественного определения патогенов методом ПЦР, либо обладают меньшей чувствительностью по сравнению с качественными (большинство наборов с внутренним контролем), либо требуют значительно больших затрат расходных материалов (метод последовательного разведения). Кроме того, в условиях использования реального клинического материала нередко наблюдаются парадоксальные ситуации, когда образцы с большим содержанием определяемой ДНК дают более слабое свечение, чем пробы, бедные мишенями , и наоборот.

Целью данной работы была оценка эффективности качественного определения возбудителей инфекций, передающихся половым путём (ИППП) на основании сопоставления частоты их обнаружения до проведения лечения и по окончании терапии.

Материалы и методы.

Материал (моча, соскобы из цервикального канала, уретры, эпителий из заднего свода влагалища, аспираты из полости матки) получали от женщин, обращавшихся за помощью к врачам-гинекологам женских консультаций г. Хабаровска. Всего было обследовано 2112 человек, 1747 из них - при первичном посещении врача и 365 - после проведения лечения. Количество анализов составило соответственно 6728, 6179 и 549. Контрольное исследование осуществляли не ранее, чем через 14 дней (для хламидий - не ранее одного месяца) после окончания терапии. Для проведения ПЦР использовались российские диагностические тест-системы ( горячий старт ) по технологии, рекомендованной производителем наборов. Результаты детекции документировались фотографированием геля на фотоплёнку Микрат-300 . За счёт высокого коэффициента контрастности (? = 4,0) и длительной экспозиции фиксировались полосы амплификата, недоступные для визуального различения. Данные хранились и обрабатывались в СУБД MS Access 97.

Результаты и обсуждение.

Проведённое исследование показало, что Chlamidia trachomatis и Mycoplasma hominis присутствовали соответственно в 20,5 и 31,8% исследованных образцов (см. Таблицу 1). Частота выявления этих микроорганизмов существенно не отличалась во время первого посещения врача и при контрольном исследовании после лечения. Кажущийся парадокс легко объясним: терапия была назначена тем женщинам, у которых был обнаружен возбудитель заболевания, иначе говоря, - инфицированность в этой группе первоначально составляла 100% а после проведения лечения снизилась для микоплазм втрое и впятеро для хламидий.

M.genitalium в пробах, взятых до начала терапии, встречалась в 9,3% (в контроле после лечения - 6,4%), U.urealiticum - 62,8% (53%). Персистенция цитомегаловируса в цервикальном канале установлена в 21,1% (проводимое лечение снизило этот процент до 13,3), вирус простого герпеса обнаружен в 18,3% (9,1%).

Приведённые результаты с определёнными оговорками позволяют оценить устойчивость различных групп микроорганизмов к терапии (в частности, учитывая того, что большой объём выборки по различным медицинским учреждениям нивелировал особенности схем лечения). Так, практически при одинаковой частоте обнаружения трихомонад и кандид до начала терапии (около 23%), первые впоследствии идентифицированы только у 14,3%, а вторые выявлены у 40% лечившихся женщин. Полученные данные хорошо вписываются в наблюдаемую нами в последнее время картину: трихомониаз и гонорея, в отличие от других ЗППП, стали встречаться реже (это же показывает и Российская статистика). В то же время, рецидивирующие кандидозы и бактериальные вагинозы (БВ) стали настолько обычным явлением (например, последние мы диагносцируем у 26% женщин), что некоторые врачи стали считать их вариантом нормы. Что же показывает проведённое исследование? Gardnerella vaginalis не только чаще других обнаруживает себя в генитальном тракте женщин, но и делит пальму первенства по устойчивости к проводимой терапии (50%) с U.urealiticum (53%) - вторым, едва ли не облигатным компонентом биоценоза влагалища при БВ. О третьем компоненте - Mycoplasma hominis- было сказано выше.

Понимая безусловную неприемлемость полуколичественной оценки ПЦР в каждом отдельно взятом исследовании, мы предприняли попытку использовать данный метод для сравнительной оценки относительно больших групп (женщин до начала лечения и после его завершения). В этом случае девиации, связанные с наличием ингибиторов термостабильной полимеразы и т.п. взаимно гасятся в обеих исследуемых группах, поскольку начинают работать законы статистики для больших популяций.

Интенсивность свечения полосы продукта амплификации сопоставляли с люминисценцией амплифицированного фрагмента соответствующей контрольной ДНК (4 балла, или 4+). Невидимой глазом, фиксированной только на фотоплёнке светящейся полосе амплификата соответствовал 1+. Остальные градации занимали промежуточное положение.

Результаты такого полуколичественного исследования приведены в Таблице. Наиболее интересным нам представляется оценка интенсивности реакции в группе хламидий. Если при первичном исследовании полосы продукта амплификации светились довольно ярко (во все балльные интервалы попало приблизительно одинаковое число проб), то в контрольном тесте явно преобладали крайне слабые (невидимые глазом, но совершенно чётко зафиксированные на фотоплёнке) сигналы. Видимые полосы составили в контроле менее трети от всех обнаруженных!

Как указывалось, контрольное исследование на хламидии проводили через месяц и более после завершения терапии, когда происходило полное замещение клеток призматического эпителия и элиминация находящихся в них погибших ретикулярных и элементарных частиц хламидий. Проводимые контрольные исследования не показали наличия полос в отрицательных контролях . Поэтому приведённые выше результаты не могут быть следствием технологических погрешностей.

По-видимому, приведённые факты должны побудить сделать соответствующие выводы исследователей, игнорирующих применение фотографических или электронных (чувствительная видеокамера? компьютер) технологий фиксации результатов амплификации.

При трактовке результатов ПЦР врач должен учитывать современное состояние вопроса: хламидийная инфекция коварна. Этот вид микроорганизмов представляет собой реальную угрозу для женщины и ребёнка даже в минимальных количествах, выявляемых молекулярно-биологическими методами.

Не существует чётких критериев степени опасности присутствия разного количества CMV и HSV в цервикальном канале, но достоверно известно, что сам факт их персистенции определяет значительно более высокий процент инфицирования ребёнка в родах даже у серопозитивных, обладающих определённым иммунитетом, женщин. При первичном инфицировании частота и тяжесть вирусных поражений многократно возрастают.

Несколько сложнее трактовка выявления микоплазм. Известно, что, например, уреаплазмы могут длительное время персистировать в урогенитальном тракте, не вызывая видимых патологических изменений. Высокий процент обнаружения данного вида микроорганизмов в наших исследованиях также косвенно свидетельствует об отсутствии 100% патогенности. Учитывая побочные действия антибиотиков, при отсутствии клинических проявлений обнаружение уреаплазм не должно служить показанием к антибиотикотерапии (исключение - планируемая беременность - см. ниже), может быть рекомендована коррекция иммунитета. Тем не менее, при воспалительном процессе выявление уреаплазм в отсутствии других патогенов позволяет считать их этиологическим фактором заболевания. Не располагают к благодушию и приведённые выше результаты: U.urealiticum неожиданно оказалась микроорганизмом, максимально устойчивым к проводимой терапии. Многие исследователи указывают на взаимосвязь присутствия уреаплазм в цервикальном канале беременных с преждевременным разрывом амниотической оболочки и излитием околоплодных вод; профилактическая антибиотикотерапия уменьшала как частоту выявления уреаплазм, так и риск преждевременных родов.

Таким образом, при выявлении потенциально патогенных бактерий и вирусов не следует забывать о том, что болезнь есть взаимодействие микро- и макроорганизма. Во многих случаях количественные критерии оказываются неприменимыми: инфекционный процесс может быть гораздо более опасным в присутствии относительного небольшого количества высокопатогенных возбудителей, при активном синергизме патогенов, при временном ослаблении иммунной системы.

Всё это позволяет считать, что даже количественная модификация метода ПЦР может и должна применяться при установлении этиологических факторов заболеваний урогенитальной сферы.

Метод высоко информативен не только при первичной диагностике инфицирования урогенитального тракта, но и при контроле излеченности от ИППП. В сочетании с другими методами диагностики он даёт думающему врачу полную информацию для принятия правильного решения.


* Ивашков Е.А. Место качественной модификации метода ПЦР в первичной диагностике ИППП и контроле эффективности лечения . Сб. тез. докл. 3-й Всероссийской научно-практической конференции Генодиагностика в современной медицине, Москва, 25-27 января 2000 г. . М., 2000. с. 102-106.

Статья опубликована на сайтеhttp://www.rusmg.ru