Клинико-экспериментальное исследование
Д.м.н. Сопуев А.А., Колигов Б.М.
Национальный хирургический центр Кыргызской Республики, г. Бишкек
Несмотря на крупные достижения в хирургическом лечении больных острыми холециститами эта проблема по-прежнему является одной из ведущих в неотложной хирургии. Это объясняется ежегодным увеличением заболеваемости ОХ как в мире, так и в Кыргызской Республике. Это свидетельствуют о том, что наши знания о патогенезе ОХ не достаточны.
Влияние острого воспаления желчного пузыря на иммунитет изучалось и продолжает изучаться до последнего времени. Установлено, что при ОХ в организме больного развивается угнетение иммунитета, сопровождающееся уменьшением уровня иммуноглобулинов и нарушениями клеточного иммунитета.
Тщательно в настоящее времени изучены показатели «кислородного градиента» при ОХ. Установлено, что в организме при ОХ развивается гипоксемия.
Угнетение клеточного и гуморального иммунитета при ОХ объясняется влиянием продуктов воспаления и нейрореципрокными воздействиями воспаленного ЖП на организм. Вместе с тем в литературе имеются единичные исследования о влиянии самого воспаленного ЖП на иммунитет и «кислородный градиент». В то же время это затрудняет научное обоснование профилактики и лечение депрессии иммунитета и гипоксемии при хирургическом лечении ОХ.
Цель работы: - изучение влияния гуморальных факторов желчного пузыря больных хроническими калькулёзными, острыми катаральными, флегмонозными и гангренозными холециститами после лапароскопической холецистэктомии на иммунитет и «кислородный градиент» в эксперименте на кроликах.
Общая характеристика клинического материала. Клинико-лабораторные исследования выполнены у 130 больных ОХ, поступивших в НХЦ МЗ КР за период 1999-2002 г.
В основной клинической группе было 130 больных ОХ: 61 больной хроническими калькулезными холециститами (ХКХ), 12 больных острыми катаральными холециститами (ОКХ), 45 больных острыми флегмонозными холециститами (ОФХ) и 12 больных острыми гангренозными холециститами (ОГХ.
Из всех 130 прооперированных больных 114 составили женщины и 16 мужчины. ОКХ у 11 женщин и 1 мужчины, ОФХ у 36 женщин и 9 мужчин, ОГХ у 4 мужчин и 8 женщин и ХКХ у 59 женщин и 2 мужчин. Средний возраст больных составил 48,6±2,3 лет.
Все больные ОХ обследовались в момент поступления в НХЦ МЗ КР, на 1-е, 3-и, 5-е сутки и перед выпиской после ЛХЭ. Удаленные воспаленные ЖП больных холециститами по формам ОХ накапливались и хранились в морозильнике при t-20° С. В дальнейшем из этих ЖП по авторской технологии В.Х. Хавинсона, В.Г. Морозова (1980) методом уксуснокислой экстракции выделено 9 пептидных фракций.
Методы и сроки клинико-лабораторных и экспериментальных исследований. На микроаструпе «Compact-2» полуавтоматическом микропроцессорном анализаторе определяли показатели кислотно-шелочного равновесия (КЩР): активность ионов водорода (рН), парциальное давление двуокиси углерода (рСО2), парциальное давление кислорода (рО2), избыток оснований (ВЕ), избыток оснований во внеклеточной жидкости (BЕecf), буферная емкость (ВВ), бикарбонат (-НСО3). Также изучалось содержание Т- и В- лимфоцитов, Т-супрессоров, суммарный цитотоксический коэффициент, фагоцитарный показатель, среднее количество частиц поглощенного латекса на одну клетку исходя из 100 клеток и интегральный фагоцитарный индекс. Гуморальный иммунитет оценивали по количественному содержанию IgА, IgM, IgY. Изучены 23 показателя сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза. Для контроля все вышеуказанные показатели исследованы у 10 практически здоровых людей. В работе также использовались общепринятые методики определения уровня гемоглобина (Нb), числа эритроцитов, цветного показателя (ЦП), гематокрита (Ht), числа лейкоцитов (L), лейкоформулы и СОЭ.
Характеристика экспериментального материала. Эксперименты проведены в летне-осенний период 2000г на 70 беспородных кроликах обоего пола, массой от 2 до 3 кг. Все животные до экспериментов содержались в виварии не менее 2-х недель, где они находились на обычном рационе, утвержденном ГОСТом для кормления животных. Обследование иммунитета и «кислородного градиента» проводили до опытов (фон), на 15-й день внутримышечного введения пептидных фракций, а также на 10-й, 20-й и 30-й дни (соответственно 25-й, 35-й, 45-й дни опыта) после окончания 15-ти дневного внутримышечного введения. Пептидные фракции в наших опытах животным вводились внутримышечно в дозе 1 мг/кг массы тела. Перед введением пептидные фракции разводились в стерильном физиологическом растворе. Препараты вводились 1 раз в сутки в течение 15 дней. В качестве контроля (препарата сравнения) 7 животным в таком же объеме вводился стерильный 0,9% раствор хлорида натрия в те же сроки.
Работа с животными: До начала проведения экспериментов у животных тщательно выстригали шерсть в паховой области левого бедра. В течение 2-х недель до начала опытов каждый день один раз в сутки, каждое животное помещали на стол, и после обработки 1% спиртовым раствором йода производили одноразовым шприцом с иглой укол. Такая 2-х недельная тренировка животных позволила нам выработать «динамический стереотип» у них поведения и исключить влияние болевого постинъекционного стресса на изучаемые показатели.
Получение крови и плазмы: Кровь через силиконовый катетер из левого желудочка сердца, a. и v. pulmonalis забирали в силиконированную посуду с цитратом натрия (3,8%) в соотношении 9:1 и тот час же центрифугировали в течение 10 мин. при 1500 об/мин. Полученную плазму сразу отсасывали в силиконированную посуду и применяли в эксперименте. Кроме того, кровь помещали в кювету электрокоагулографа Н–334 (333) и записывали показатели электрокоагулограммы.
Экспериментальные кролики были разбиты на следующие группы:
1. 7 животных, у которых был обследован общий фон, характеризующий состояние клеточного, гуморального иммунитета и «кислородного градиента». Этим же животным в дальнейшем вводился физиологический раствор (группа сравнения).
2. 7 кроликов, у которых было исследовано состояние иммунитета и «кислородного градиента». Однако им в дальнейшем внутримышечно вводилась пептидная фракция ХКХG1 в течение 15-ти дней.
3. 7 кроликов, которым после фонового обследования 15 дней внутримышечно вводилась фракция ХКХG2.
4. 7 кроликов, подвергались, фоновому обследованию и им внутримышечно вводилась фракция ХКХG3.
5. 7 кроликам после фонового обследования внутримышечно вводили пептидную фракцию ХКХG4.
6. 7 кроликов также исследовали, до начала опытов и им внутримышечно вводился, пептид ОКХG.
7. 7 кроликов после фонового обследования в течение 15 дней получали внутримышечно инъекции пептидной фракции ОФХG1.
8. После фонового обследования 7 кроликов в течение 15 дней внутримышечно получали пептидную фракцию ОФХG2.
9. После фонового обследования 7 кроликов внутримышечно получали пептидную фракцию ОФХG3.
10. После фонового обследования 7 кроликам внутримышечно в течение 15-ти дней вводили пептид ОГХG.
Полученный материал обработан по Стьюденту методами вариационной статистики для связанных и не связанных между собой наблюдений и вычислен показатель достоверности различий (Р).
Результаты собственных исследований. Из воспаленных удаленных ЖП больных ХКХ после ЛХЭ выделяются 4, из ОКХ- 1, из ОФХ – 3 и ОГХ –1 пептидная фракция. Все выделенные пептидные фракции обладают способностью влиять на показатели «кислородного градиента» и иммунитета. У больных ХКХ с 44,3± 1,9
мм рт.ст. увеличено до 46,2± 1,2 мм рт.ст. (P<0,05) р СО2, уменьшен с 3,9± 0,1 ммоль/л до 3,1± 0,1 ммоль/л (P<0,001) показатель ВЕ. У больных ХКХ до операции выявляется алкалоз, гиперкапния, гипоксемия и снижение показателей ВЕ, ВЕecf и ВВ. В первые сутки после ЛХЭ в организме этих больных формировался ацидоз, продолжало нарастать рСО2 увеличивался показатель ВЕ и уменьшался ВЕecf. Одновременно в крови больных выявлялась эритроцитопения. У больных ХКХ до операции выявлялось снижение клеточного и гуморального иммунитета: снижалась интенсивность восстановления нитросинего тетразолия, СЦК, уменьшалось число нейтрофилов способных осуществлять фагоцитоз, снижался уровень IgA, IgM. Отметим также, что у больных до операции было с 51,2±2,9% снижено до 48,2± 1,3% содержание Т-лимфоцитов и увеличен с 108,8± 5,8 усл.ед. до 116,7± 5,6 усл. ед. (P<0,05) уровень ЦИК. В течении 1-х суток после ЛХЭ количество Т-лимфоцитов с 48,2±1,3% возрастало до 53,1± 2,3% (P<0,05), не изменялось процентное содержание В-лимфоцитов, Т-хелперов, падало содержание Т-супрессоров, продолжал нарастать уровень ЦИК, сохранялась угнетенной интенсивность восстановления нитросинего тетразолия и СЦК. Все 4 выделенные пептидные фракции из ЖП больных ХКХ однонаправленно формировали в организме кроликов алкалоз, так как рН уменшалась с 7,3±0,0013 усл. ед. до 7,2± 0,01 усл. ед., увеличивалась с 44,3± 1,9 мм рт.ст. до 49,1± 1,0 мм рт.ст. рСО2. Эта гиперкапния на 25-й день опыта увеличивалась до 52,1±1,1 мм рт.ст. (P<0,001), на 35-й день до 58,1±1,1 мм рт.ст. (P<0,05). Одновременно эти фракции на 15-й день опыта четко формировали в организме кроликов выраженную гипохромную анемию, так как ЦП с 0,9± 0,01 усл. ед. уменьшался до 0,8±0,003 усл. ед. (P<0,05). У опытных кроликов все 4 пептидные фракции ХКХ вызывали лейкоцитопению (P<0,05), не влияли на СОЭ и на процентное содержание в лейкоформуле палочкоядерных, сегментоядерных лейкоцитов, эозинофилов и моноцитов. Во всех 4 экспериментальных группах после 15-ти дневного внутримышечного введения выделенных пептидов уменьшалось количество Т-лимфоцитов (P<0,05), возрастал с 30,5± 1,1% до 35,4±3,1% (P<0,05) уровень В-лимфоцитов, Т-хелперов (P<0,05), Т-супрессоров (P<0,05). Одновременно пептидные фракции ХКХ в крови кроликов увеличивали уровень ЦИК (P<0,05), снижали интенсивность восстановления нитросинего тетразолия (P<0,05). Также уменьшалось количество лейкоцитов способных выполнять фагоцитоз с 44,2±4,2% до 33,2± 4,0% (P<0,05) и до 32,4± 1,7% (P<0,05) на 15-й и 45-й дни наблюдений. В крови опытных животных на 15-й день опыта с 3,1±0,2 г/л уменьшался до 2,0± 0,2 г/л (P<0,001) уровень IgA. Одновременно IgM снижался на 15-й и 45-й дни соответственно до 1,5±0,1 г/л (P<0,05) и до 1,4± 0,1 г/л (P<0,05).
Таким образом, при ХКХ в организме больных развивается гипоксемия, гиперкапния и накопление щелочных соединения. Из удаленных воспаленных ЖП больных ХКХ выделяются 4 пептидные фракции, которые после 15-ти дневного внутримышечного введения экспериментальным животным вызывают угнетение клеточного и гуморального иммунитета, гипоксемию и гиперкапнию аналогичную у больных ХКХ.
Из удаленных воспаленных ЖП при ОКХ выделяется 1 пептидная фракция. У больных ОКХ в крови с 44,3± 1,9 мм рт.ст. до 46,0± 1,1 мм рт.ст. (P<0,01) увеличено рСО2. Уменьшены показатели ВЕecf (P<0,05), ВВ (P<0,05) и довольно резко с 37,9± 1,8 мм рт.ст. уменьшено до 26,7± 2,1 мм рт.ст. (P<0,001) рО2. У больных ОКХ с 50,9± 1,9% снижено до 40,1± 1,0% (P<0,05) количество Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов (P<0,005). Эта Т- и В- лимфоцитопения сопровождалось при ОКХ увеличением с 107,8± 5,1 усл. ед. до 118,2± 5,1 усл. ед. уровня ЦИК. Также до операции и в течение 1-х суток после неё у больных ОКХ с 1,1±0,1 был снижен до 0,7± 0,2 (P<0,05) и до 0,9± 0,02 (P<0,01) СЦК. При ОКХ уменьшается количество нейтрофилов способных к фагоцитозу (P<0,05), снижен стандартный тест пожирания частиц латекса нейтрофилами (P<0,05). Показатели гуморального иммунитета при ОКХ угнетены, уменьшается уровень IgA, IgM. 15-ти дневное внутримышечное введение экспериментальным кроликам фракций, выделенных из ЖП ОКХ формирует в организме животных алкалоз, накопление с 44,3±1,9 мм рт.ст. до 50,0± 1,1 мм рт.ст. (P<0,05) рСО2, уменьшение с 37,9± 1,8 мм рт.ст. до 28,3± 1,2 мм рт.ст. (P<0,05) рО2 и снижение показателей ВЕ, ВEecf и ВВ. Одновременно в крови опытных животных после введения этих фракций было снижено количество эритроцитов (P<0,05), падал ЦП (P<0,05), не изменялось число лейкоцитов и СОЭ. Хотя содержание в лейкоформуле лимфоцитов было увеличено (P<0,001). У всех животных, которым вводились фракции ОКХG было снижено количество Т-лимфоцитов (P<0,001), В-лимфоцитов (P<0,05), возрастало число Т-супрессоров (P<0,001), и уменьшался уровень ЦИК (P<0,001). Депрессия клеточного иммунитета также подтверждается уменьшением с 98,0± 0,4% до 0,5±0,2% НСТ (P<0,001), снижением показателей ФП, ФЧ и ИФИ.
Таким образом, из ЖП ОКХ выделяется 1 пептидная фракция. В организме больных ОКХ развивается депрессия клеточного, гуморального иммунитета, гипоксемия и гиперкапния. После 15-ти дневного внутримышечного введения выделенной из ЖП больных ОКХ пептидной фракции в организме животных, также как и у больных ОКХ, формируются депрессия клеточного, гуморального иммунитета, гипоксемия и гиперкапния.
Из ЖП при ОФХ выделены 3 пептидные фракции. У больных ОФХ в крови увеличено содержание в крови соединений обладающих щелочными свойствами, имеется гипоксемия и гиперкапния. Как правило, при ОФХ регистрируется выраженная гипохромная анемия, снижены показатели клеточного и гуморального иммунитета. У таких больных до операции с 51,2± 2,9 уменьшается до 45,1±1,2 (P<0,001) содержание Т-лимфоцитов, не изменяется количество В-лимфоцитов. Однако содержание Т-хелперов на 1-е и 3-и сутки после ЛХЭ прогрессивно уменьшается, увеличивается уровень ЦИК (P<0,001), снижено количество нейтрофилов способных к фагоцитозу (P<0,05). Уровень IgA при ОФХ был уменьшен в крови с 3,8± 0,2 г/л до 2,4±0,2 г/л (P<0,05). Уровень IgM при ОФХ был резко снижен как до операции (P<0,05), так и 1-е (P<0,05) и на 3-и сутки после неё (P<0,05). Все 3 пептидные фракции, выделенные из ЖП при ОФХ после 15-ти дневного внутримышечного введения кроликам формировали алкалоз, гиперкапнию и гипоксемию. Одновременно эти пептидные фракции увеличивали у кроликов такие показатели номограммы, как ВЕ, ВЕecf соответственно до 5,2± 0,1 ммоль/л (P<0,001) и до 4,0± 0,1 ммоль/л (P<0,001). В крови опытных животных на 15-й день внутримышечного введения этих фракций регистрировалась гипохромная анемия (P<0,05), лейкоцитопения и лимфоцитоз. Все 3 фракции ОФХ на 15-й день внутримышечного введения уменьшали количество Т-лимфоцитов (P<0,001). Однако содержание В-лимфоцитов с 30,7±1,2% возрастало до 38,6± 2,2% (P<0,05) на 15-й день и сохранялось на уровне 33,2± 1,2% (P<0,05) на 25-й и 35-й дни опытов (P<0,05). Все 3 пептидные фракции ОФХ значительно снижали у кроликов число лейкоцитов, способных к фагоцитозу (P<0,001). Также были уменьшены такие показатели фагоцитоза опытных кроликов как ФП, ФЧ и ИФИ (P<0,05). Содержание IgA на 15-й день опыта с 3,8±0,2 г/л уменьшалось до 2,0± 0,1 г/л (P<0,05) и продолжало падать до 1,6± 0,1 г/л (P<0,001) на 25-й и до 1,5± 0,2 г/л (P<0,001) на 35-й дни опыта. Уровень IgM и IgY также прогрессивно уменьшался на 15-й (P<0,05), на 25-й (P<0,001) и 35-й (P<0,001) дни.
Таким образом, в организме больных ОФХ регистрируется гипоксемия, гиперкапния и накопление уровня щелочных соединений. Из ЖП при ОФХ выделяется 3 пептидные фракции, которые после 15-ти дневного внутримышечного введения в организме кроликов формируют сдвиги показателей «кислородного градиента», клеточного и гуморального иммунитета аналогичные изменениям у больных при ОФХ.
У больных ОГХ выявляется при поступлении снижение с 37,9± 1,8 мм рт.ст. до 27,7± 2,1 мм рт.ст. рО2 (P<0,05), увеличение с 4,3± 1,9 мм рт.ст. до 46,2±1,1 мм рт.ст. (P<0,01) рСО2. Эти изменения показателей «кислородного градиента» сохраняются в крови до 3-х суток после ЛХЭ. Также у больных ОГХ выявляется уменьшение уровня Т-лимфоцитов (P<0,05), В-лимфоцитов (P<0,05), Т-хелперов (P<0,05), Т-супрессоров (P<0,05). Эта депрессия клеточного иммунитета подтверждается уменьшением с 98,0± 0,6% до 68,9± 1,1% НСТ(P<0,05) и СЦК (P<0,05). При ОГХ снижается число лейкоцитов способных к фагоцитозу, так как ФП (P<0,05) и ФЧ (P<0,05) снижены. У больных при ОГХ уменьшен уровень IgA (P<0,05), IgM (P<0,05). Из ЖП больных ОГХ выделена 1 пептидная фракция. Внутримышечное введение этой фракции в течение 15 дней у опытных животных вызывает изменения показателей «кислородного градиента», клеточного и гуморального иммунитета аналогичные больным ОГХ.
Влияние 15-ти дневного внутримышечного введения всех 9 выделенных пептидных фракций прослеживалось в крови взятой из сердца, а. и v. pulmonalis. Если учесть результаты наших предыдущих исследований и наши данные то, очевидно, что пептидные фракции циркулируют в организме больных ОХ и экспериментальных кроликов после 15-ти дневного введения. Согласно современным литературным данным на мембране эритроцитов имеются специфические рецепторы, к которым могут соединяться регуляторные пептиды. Мы в своем исследовании в качестве мессенджер-системы выбрали гемостаз и изучили влияние in vitro выделенных пептидных соединений на показатели свертывания крови. Оказалось, что при комбинированном ведении нескольких пептидных фракций выявляется потенцирующий эффект их влияния на показатели гемостаза. Оказалось, что в присутствии in vitro все выделенные 9 пептидные фракции способны нарушать процессы присоединения и отдачи кислорода в эритроцитах. Выделенные пептидные фракции циркулируют в крови на мембране эритроцитов. 3-х кратное отмывание с физиологическим раствором эритроцитов способно удалять эти пептидные фракции в промывочные воды. Мы полагаем, что локализация гуморальных факторов воспаленного ЖП на мембране эритроцитов обусловливают гипоксемию и гиперкапнию в организме больных ОХ, сохраняющиеся даже на 3-и сутки после ЛХЭ. Эти выявленные нами факты свидетельствуют о неэффективности нормобарооксигенотерапии у больных ОХ до операции и в послеоперационном периоде. Результаты нашей работы позволяют предложить важные для клиники практические рекомендации. Они заключаются в том, что для эффективной коррекции иммунитета и показателей «кислородного градиента» у больных ОХ при осложненном послеоперационном периоде, мы предлагаем эритроциты больного 3-х кратно отмывать физиологическим раствором с последующей аутореинфузией их.
Выводы:
1. У больных хроническими калькулезными, острыми катаральными, флегмонозными и гангренозными холециститами до лапароскопической холецистэктомии выявляется депрессия клеточного и гуморального иммунитета, гипоксемия, гиперкапния и накопление в крови основных соединений.
2. Гуморальные факторы, выделенные из желчных пузырей у больных острым холециститом, после 15-ти дневного внутимышечного введения в организме животных, также как и у больных, формируют депрессию клеточного, гуморального иммунитета, гипоксемию, гиперкапнию и накопление основных соединений в крови.
3. Выделенные гуморальные факторы циркулируют в крови больных острыми холециститами и экспериментальных животных после 15-ти дневного внутримышечного введения.
4. Эти гуморальные факторы воспаленных желчных пузырей в организме больных острыми холециститами и экспериментальных животных локализуются в структуре «белковой рубашки» эритроцитов.
5. Локализация этих гуморальных факторов в структуре «белковой рубашки» эритроцитов нарушает процессы присоединения и отдачи кислорода, углекислоты в организме больных острыми холециститами и экспериментальных животных, что проявляется гипоксемией, гиперкапнией и накоплением основных соединений в крови.
Список терминологических сокращений
АКТ - аутокоагуляционный тест;
Ат III - антитромбин III;
ВВ - буферные основания;
ВЕ – избыток оснований;
ВЕecf – избыток оснований во внеклеточной жидкости;
ЖП – желчный пузырь;
ИФИ – интегральный фагоцитарный индекс;
КЩР – кислотно-щелочное равновесие;
ЛХЭ - лапароскопическая холецистэктомия;
НСТ – нитросиний тетразолий;
-НСО3 – бикарбонат;
ОКХG - пептидная фракция, выделенная из острых катаральных желчных пузырей;
ОФХG1,G2, G3 - первая, вторая и третья полипептидная фракция, выделенная из острых флегмонозных желчных пузырей;
ОГХG - пептидная фракция, выделенная из острых гангренозных желчных пузырей;
ПДФ - продукты деградации фибрина;
П/я – палочкоядерные лейкоциты;
рН – активность ионов водорода;
СЦК – суммарный цитотоксический коэффициент;
С/я – сегментоядерные лейкоциты;
ТПГ - толерантность плазмы к гепарину;
ФА – фибринолитическая активность;
ФП – фагоцитарный показатель;
ХКХG1, G2, G3, G4 - первая пептидная фракция, выделенная из хронических калькулезных желчных пузырей;
ЦП – цветной показатель;
IgA, IgM, IgY – иммуноглобулины.
Главная страница --> 