Рузам - новый подход в лечении и профилактике аллергических заболеваний (экспериментальные и клинические данные)

Академик РАМН, профессор А.Г. Чучалин, профессор В.Л. Ковалёва, д.м.н. Н.А. Колганова
НИИ пульмонологии МЗ РФ, Москва

Рузам – новый антиаллергический препарат, разработанный в НИИ пульмонологии МЗ РФ, представляет собой по химической структуре липопротеин, полученный по оригинальной технологии из термофильного микробного штамма St. aureus, запатентованный в России, имеет международный приоритет. Показаниями к его применению является широкий спектр аллергических заболеваний.

Более 30 лет назад выдающийся российский ученый–фармаколог Н.В. Лазарев подчеркивал важность «изыскания средств воздействия на те готовые и рациональные, создававшиеся в длительном процессе эволюции организма комплексные реакции, которые играют в жизненном процессе исключительную роль и без которых вряд ли врачебные вмешательства были бы эффективными достаточно часто» [1].

В связи с этим особый интерес представляют лекарственные вещества, созданные на основе эндогенных субстратов. Такого рода препараты особенно важны в терапии аллергических заболеваний и, в первую очередь, наиболее распространенных из них – бронхиальной астмы, аллергических ринитов, атопических дерматитов. Исключительно большое значение для нового направления поиска лекарственных средств для патогенетической терапии указанных заболеваний имеют полученные в последние годы доказательства мультисистемности атопии, проявляющейся в функционально–морфологических изменениях различных отделов ЖКТ [2]. На большом клиническом материале показано, что воспалительные изменения слизистой ЖКТ аллергической природы, наблюдаемые в 98% случаев у больных бронхиальной астмой, атопическим дерматитом и другими аллергическими заболеваниями, поддерживаются длительной персистенцией хелико– и кампилобактерий. Нельзя исключить участие в этом процессе и других микроорганизмов, колонизирующих респираторный и желудочно–кишечный тракт [2].

В связи с этим следует вспомнить, что макроорганизм и его бактерии – это древнейшая симбиотическая система, возникшая одновременно с формированием пищеварительной трубки макроорганизма. Известно, что дисбактериоз кишечника является тяжелой патологией макроорганизма и что безмикробные животные представляют собой уникальную модель иммунодефицита, с одной стороны, и модель дефицита системы цитохрома Р–450 печени, с другой. У таких животных снижены содержание цитохрома Р–450, а также активность ряда важнейших ферментов: NADPH–цитохром Р–450–редуктазы, глутатион–S–трансферазы и эпоксидгидролазы [3].

Микробное сообщество кишечника – это не только древнейший регулятор пишеварения, но и мощный «метаболический орган» макроорганизма, имеющий гуморальные регуляторные связи с цитохром Р–450 – зависимой метаболической системой печени, реализуемые глико– и липопротеинами, липополисахаридами и другими веществами, которые продуцируют бактерии [3]. В оболочках клеток практически всех бактерий имеется пептидогликановый или мукопептидный слой, скелетную основу которого составляют чередующиеся молекулы N–ацетилмерамурамовой кислоты и N–ацетилглюкозамина. Эти гликопептиды рассматривают в настоящее время как регуляторы различных функций макроорганизма, в том числе активности иммунной и нервной систем. Установлено, что персистирующие микроорганизмы инициируют целый каскад иммунологических реакций с выделением большого числа провоспалительных медиаторов: лейкотриенов, простагландинов, нейропептидов, цитокинов – IL–4, IL–5, IL–6, IL–13, TNF-a, хемокинов и др. факторов. Таким образом, лимфоидная ткань, ассоциированная не только с бронхами и ротоглоткой, но и с кишечником, в комплексе с цитохром Р–450 – зависимой метаболической системой печени и легких, становится центральным звеном активации основных патогенетических реакций, лежащих в основе аллергического процесса.

Именно с этих позиций, как нам кажется, следует рассматривать механизмы действия оригинального препарата Рузам.

Для изучения антиаллергических свойств Рузама мы использовали экспериментальные модели аллергии. Важнейшей из них, наиболее адекватной бронхиальной астме у человека и весьма информативной является модель аллергического воспаления легких у морских свинок. Основу этого аллергического процесса, индуцируемого аэрозольным введением антигена (овальбумина), составляет эозинофильное воспаление, характеризующееся инфильтрацией паренхимы легких эозинофилами, повышением цитоза в бронхоальвеолярном смыве (БАС), а также резким увеличением количества эозинофилов и нейтрофилов в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) (в 4–5 и 6–7 раз по сравнению с исходным уровнем, соответственно). Кроме того, аллергический характер воспаления подтверждается усилением дегрануляции тучных клеток, уменьшением возврата бронхоальвеолярной жидкости (вследствие спазма бронхов), значительным увеличением медиаторов аллергии и воспаления в БАЛ – гистамина, PGE, LTC, TBxB. Развитие аллергического воспаления в легких морских свинок сопровождалось гиперплазией бронхоассоциированной лимфоидной ткани [4].

Рузам при курсовом ингаляционном введении (ежедневно 1 раз в день в течение 6 дней) в дозе 40 мкг белка/мл эффективно снижал проявления аллергической воспалительной реакции в легких морских свинок: достоверно уменьшал показатель цитоза; по данным эндопульмональной цитограммы, значительно снижал процентное содержание эозинофилов (в 2 раза) и нейтрофилов (в 2,7 раза) в БАЛ и межальвеолярных перегородках. По абсолютным показателям выявлена та же закономерность: значительное снижение количества эозинофилов в БАС (в 2 раза) и снижение количества нейтрофилов (в 3 раза). По данным морфометрии Рузам в 4 раза уменьшал содержание полиморфноядерных лейкоцитов, преимущественно эозинофилов, в легких (до нормы), нормализовал содержание тучных клеток в легком и индекс дегрануляции. При гистологическом исследовании легких практически отсутствовали явления воспаления и обструктивной эмфиземы, характерные для контрольной группы. Кроме того, объем возврата БАС (показатель степени расширения бронхов под воздействием проводимой терапии) достоверно возрастал и приближался к контрольным цифрам. В отличие от Рузама кромогликат натрия в условиях данной модели оказывал лишь слабый эффект на аллергический процесс в легких, который оценивали по тем же показателям.

Выявленные терапевтические эффекты Рузама, в первую очередь, значительное снижение числа эозинофилов в БАЛ и подавление Th–2– зависимой эозинофильной инфильтрации в легких позволяют предположить, что одним из механизмов действия Рузама является индукция апоптоза эозинофилов и нейтрофилов или какой–то иной путь подавления синтеза или экспрессии рецепторов ключевых Th–2 – зависимых цитокинов. Не менее существенную роль может играть и другой механизм, заключающийся в торможении под действием Рузама миграции Т–лимфоцитов в легкие, инициируемой разрешающей дозой антигена.

Действие Рузама исследовали и на другой классической модели аллергии – реакции пассивной кожной анафилаксии у крыс по Goose a. Blair, которую вызывали с помощью внутрикожной инъекции гомологичной сыворотки с титром IgE–антител 1:128 и введения через 48 часов разрешающей дозы овальбумина и Evans blue (в/в). Эффект оценивали по площади окрашенного пятна на внутренной поверхности кожи спины крыс. Рузам в очень низкой концентрации (0,01%) при локальном воздействии вызывал значительное ингибирование ПКА, равное 43% (p<0,01), тогда как полькортолон в дозе, в 10 раз превышавшей дозу Рузама (0,1%), тормозил ПКА на 60% (p<0,01).

Выраженная антиаллергическая активность Рузама была показана и в тесте дегрануляции базофилов иммунизированной морской свинки in vitro. Рузам в концентрации 0,12, 0,06 и 0,006 мг/мл, не проявляя дозовой зависимости, значительно ингибировал дегрануляцию базофилов по сравнению с контролем – на 83, 106 и 101%, соответственно. Результаты экспериментов, проведенных с участием последних 2 моделей, свидетельствуют, что Рузам одинаково эффективно воздействует как на цитокин–зависимый, так и IgE–зависимые механизмы аллергического процесса.

Исходя из того, что некоторые структурные компоненты бактерий являются регуляторами системы иммунитета и, как впервые показали И.Е. Ковалев с соавт. [5], важными регуляторами центральной метаболической системы цитохрома Р–450 и сопряженной с ней NO–синтазной системы, мы исследовали влияние Рузама на некоторые гуморальные (формирование антителообразующих клеток (АОК) в селезенке, синтез антител (титры гемагглютининов)) и клеточные иммунологические реакции – реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и тест на активность нейтрофилов периферической крови (НСТ–тест – в экспериментах на мышах С 57BL).

В качестве препарата сравнения использовали известный иммуномодулятор ликопид, который является по химической структуре мурамилдипептидом (МДП). Из литературных данных известно, что МДП проявляет адъювантную активность, стимулируя продукцию антител к широкому спектру антигенов при совместном введении с антигеном в физиологическом растворе, и индуцирует реакцию ГЗТ при введении в неполном адъюванте Фрейнда. Дозы Рузама и МДП (субстанция) были выбраны на основании литературных данных и терапевтических доз препаратов. Рузам и МДП вводили подкожно в дозах 2, 20, 200 мкг/мышь (реакции ГЗТ и НСТ) и 0,2, 2, 20 мкг/мышь (определение АОК и титров ГА).

Изучение влияния препарата Рузам на количество АОК в селезенке и титры гемагглютининов. Препараты вводили по схеме –1, 0, 1, где 0 – день иммунизации мышей эритроцитами барана (ЭБ) (0,2 мл 2,5% ЭБ, внутрибрюшинно). На пятые сутки после иммунизации производили забор крови, мышей забивали и выделяли селезенку. Селезенку гомогенизировали в 5 мл среды RPMI 1640. Из крови выделяли сыворотку для определения титра антител.

Количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенках определяли методом [6] в монослое клеток, за титр принимали максимальное разведение сыворотки, при котором еще наблюдается реакция агглютинации.

Результаты изучения влияния препарата Рузам в дозах 0,2 –20 мкг белка/мышь на антителообразование в селезенке и титры гемагглютининов показали, что оба препарата не оказывали существенного влияния на количество ядросодержащих клеток (ЯСК) в селезенках, но достоверно повышали число антителообразующих клеток (АОК) как в пересчете на селезенку, так и на 106 ЯСК. Эффект Рузама существенно не отличался от эффекта МДП.

Изучение влияния Рузама на активность фагоцитирующих клеток (нейтрофилов). При оценке влияния Рузама на фагоцитоз использовали реакцию восстановления нитросинего тетразолия [7].

Изучение влияния Рузама на реакцию гиперчувствительности замедленного типа. Мышей сенсибилизировали внутрибрюшинным введением 5x106 убитых клеток Staphylococcus sp. Через 5 суток мышам делали разрешающую инъекцию клеток (107 клеток) субплантарно в правую заднюю лапку. Через 24 часа определяли онкометрически объем лапок в опыте и контроле.

Рузам в низких дозах (2–20 мкг белка/мышь) уменьшал реакцию ГЗТ и увеличивал спонтанную активность нейтрофилов, в отличие от МДП, который не вызвал эффекта в том же диапазоне доз. На основании полученных результатов был сделан вывод о том, что иммуностимулирующая активность препарата «Рузам» может проявляться в дозе 2 мкг белка/мышь или даже ниже.

Полученные результаты позволили сделать следующие важные выводы [8]:

Подытоживая результаты экспериментальной части работы, можно утверждать, что Рузам с высокой степенью эффективности ингибирует эозинофильное воспаление в легких, уменьшает проявления IgE–зависимых реакций in vivo и in vitro и в тест–системах in vivo в низких дозах оказывает умеренное иммуномодулирующее действие. Следует подчеркнуть, что в известной нам литературе не описаны аналогичные лекарственные препараты с антиаллергической активностью.

Токсикологические исследования препарата Рузам в остром опыте показали полную его безопасность. Так, дозы в 600, 3000 и 6000 раз превышающие лечебную, при парентеральном введении не вызывают ни интоксикации, ни гибели лабораторных животных.

В условиях хронического трехмесячного опыта при подкожном введении препарата в дозах 5; 25 и 100 раз превышающих терапевтическую дозу для человека была подтверждена низкая токсичность Рузама.

Клинические исследования препарата Рузам были проведены в пяти аллергологических центрах на 427 больных с различными аллергологическими заболеваниями (как с респираторной, так и кожной аллергией).

Общая оценка эффективности Рузама у больных бронхиальной астмой и аллергодерматозами дала положительный эффект у 93% больных, при этом у 61% из них результаты были оценены как хорошие и отличные. В группе сравнения, где проводилась базисная терапия без Рузама, эффект от лечения был у 84% больных (разница не существенная), при этом отличные и хорошие результаты были достигнуты только у 48% больных (разница достоверна).

В группе больных с бронхиальной астмой после лечения Рузамом появляется значительная категория больных, у которых отсутствуют приступы удушья – 44%, в то время как в группе сравнения таких пациентов было лишь 10%.

Клиническая эффективность после лечения препаратом Рузам проявлялась также в изменении тяжести течения самой бронхиальной астмы, о чем свидетельствуют данные таблицы 1.

После лечения препаратом Рузам больных легкой формой стало на 13,7% больше за счет сокращения больных среднего и тяжелого течения бронхиальной астмы. Статистически имеет место достоверность различия изменений по тяжести течения после лечения Рузамом в группах легкой и средней тяжести (рис. 1).

Изменение тяжести бронхиальной астмы произошло на фоне уменьшения объема лекарственной терапии (табл. 2, рис. 2).

Балльная оценка позволила показать преимущества терапии Рузамом по совокупности таких критериев как тяжесть приступов удушья, длительность приступного периода, тяжесть самой бронхиальной астмы, снижение объема базисной терапии. Сравнительные данные показали более заметную динамику в исследуемой группе по сравнению с контрольной (табл. 3).

На фоне лечения Рузамом происходит снижение числа эозинофилов (p<0,001) и лейкоцитов (p<0,02) крови, что указывает на уменьшение воспалительного процесса у исследуемых больных. Динамика иммунологических показателей до и после лечения Рузамом указывает на достоверное снижение IgE (рис. 3).

Препарат Рузам в значительной степени (почти в 3 раза) способствовал снижению иммуноглобулинов класса Е (р<0,01) и повышению иммуноглобулинов класса G, в то же время практически не изменил уровень иммуноглобулинов классов М и А в сыворотке крови. Отмечено повышение общего содержания Т–лимфоцитов, значительно возросли показатели нейтрофильного фагоцитоза – процент фагоцитирующих клеток и количество кокков, фагоцитированных одним фагоцитом (р<0,01).

Наблюдается заметное возрастание титра антител к стафилококку и пневмококку, чем, по–видимому, частично можно объяснить снижение под влиянием Рузама числа рецидивирующих респираторных инфекций у большинства больных.

Общая оценка эффективности Рузама у больных с бронхиальной астмой и аллергодерматозом дала положительный эффект у 93% больных, из них 61% – результаты лечения были оценены как отличные и хорошие. В группе сравнения положительный эффект от лечения был в 84% случаев (разница не существенна), при этом отличные и хорошие результаты были достигнуты у 48% больных (разница достоверна).

Побочные эффекты у большинства больных были легкими, не требовали отмены препарата или специального лечения, за исключением двух случаев (0,5%) нерезкого обострения хронического бронхита и гайморита, потребовавшего пятидневного курса антибактериальной терапии.

Доклинические и клинические исследования позволили разработать схему применения препарата Рузам: 0,2 мл подкожно 1 раз в неделю, продолжительность терапевтического курса 10 инъекций, профилактического курса 5 инъекций.

Показаниями к применению препарата Рузам являются: бронхиальная астма, атопический дерматит, аллергический ринит, крапивница и отек Квинке, частые респираторные инфекции.

Противопоказаниями к назначению препарата Рузам являются беременность, декомпенсированные заболевания внутренних органов. Нежелательные явления – в редких случаях легкое и кратковременное обострение основного аллергического заболевания или очага хронической инфекции, что, как правило, не требует отмены препарата.

Преимуществом Рузама является его способность оказывать лечебный эффект, подавляя аллергическое воспаление и предупреждая тем самым переход болезни в ее более тяжелые формы. Рузам может с успехом применяться при респираторной, кожной аллергии и мультисистемных проявлениях атопии.

1. Лазарев Н.В. Цит. По: Ермольева З.В., Вейсберг Г.Е.. Стимуляция неспецифической резистентности и бактериальные полисахариды. // Медицина, Москва,1976.

2. Колганова Н.А. Бронхиальная астма и мультисистемные проявления атопии. Новые терапевтические подходы. Автореферат докторской дисс, Москва, 2001.

3. Ковалев И.Е., Щипулина Н.В. Природный иммуноадъювант мурамилдипептид как субстрат и регулятор функции цитохрома Р–450. // Хим–фарм. журн. – 1994 –Т.28, №4. – С. 4–6.

4. Ковалева В.Л. Методические указания по изучению фармакологических веществ, предназначенных для терапии бронхиальной астмы и других обструктивных заболеваний дыхательных путей// Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, с.242–249, Москва, 2000.

5. Ковалев И.Е. и Щипулина Н.В. Ковалентное связывание ксенобиотиков с белками организма как механизм адаптации. // Хим–фарм. журн. – 1996 –Т.30, № 11. – С. 3–12.

6. Cunningham A.S., Szenberg A.// Immunology – 1968– v.14, N.5035– p.544.

7. Климов В.В., Кошовкина Т.В. Тест восстановления нитросинего тетразолия, стимулированный пирогеналом // Лаб. дело – 1982 – № 10 – с. 624–625.

8. Ковалева В.Л., Колганова Н.А., Трапкова А.А. Исследование влияния нового отечественного антиаллергического препарата Рузам на некоторые показатели клеточного и гуморального иммунитета. 12 Нац.конгресс по болезням органов дыхания. Москва. 2002,С.203.